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聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的研制与分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的研制与分析
发布人:W66利来 净水      发布时间:19-01-18       浏览次数:
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。它在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基:以R·代表自由基,M代表丙烯酰胺单体,这样由于乙烯基”CH2=CH-”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链,同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联,从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用,所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。丙烯酰胺的另一种聚合方法是光聚合,催化剂是核黄素,核黄素在光照下能够产生自由基,催化聚合反应。一般光照2-3小时即可完成聚合反应。
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的,玻璃管通常直径为7 mm,长10 cm,将凝胶装入到多个管中进行电泳,又称为柱状电泳。目前仍有应用,尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异,所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品,电泳过程中样品所处的条件比较一致,样品间可以进行更好的比较,重复性也更好,所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛,常用于蛋白质及DNA序列分析过程中DNA片段的分离、鉴定。
水平平板电泳近年来也有很快的发展,与垂直平板电泳相比也有其独特的优点:①由于凝胶可以直接铺在冷却板上,容易使凝胶冷却,因而可以加高电压以提高分辨率。②电泳速度快,通常只要1小时左右,而园盘电泳和垂直平板电泳一般需要3~4小时。③因为可以使用薄胶,加样少,染色快,从而提高了灵敏度,而且容易保存,只要用甘油浸泡后自然干燥即可长期保存不会龟裂。④便于适用各种电泳方式,用途广泛,尤其是可以使用90年代才发展起来的只有水平电泳系统才能使用的新的半干技术,即用浸有少量缓冲液的半干的胶条代替通常所用的大量电极缓冲液,大大节约了试剂,简化了操作,提高了电泳速度。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在3%-30%之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如10%-20%的凝胶常用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C,T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是: C = 6.5-0.3T
上式中a为丙烯酰胺的克数,b为甲叉双丙烯酰胺的克数,m为水或缓冲液体积(ml)。式中a与b的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶,a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是: C = 6.5-0.3T此式可用于计算T为5%~20%时的凝胶组成。C值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 ±1%,当C保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T的增加而减小,当T保持恒定,C为4%时,有效孔径最小,C大于或小于4%时,有效孔径均变大,C大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C是2.6%和3%。
操作流程:
1.安装灌胶模具,依照说明书进行
2.按照配方配置一定量(7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml)的分离胶溶液和浓缩胶溶液(2ml),过硫酸铵和TEMED在用前加入。
3.分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具,上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶,小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇(或水饱和的异丙醇、水),封住胶面,以促使聚合并保持胶面平整。
4.室温放置40分钟到1小时后,可以看到一个界面,去掉上层覆盖液,用浓缩胶缓冲液淋洗胶面,然后灌制浓缩胶,并插入与模具大小相同,凝胶厚度相当的梳子。
5.静止放置40-60分钟使凝胶聚合,电泳液清洗样品孔。
6.制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1:1混合,与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min,(7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug)
7.加入下槽液,把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽,加入上槽液,上样。
8.连接电源,5-10mA/胶开始电泳,待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶,
9.溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳,取出凝胶,做好标记,准备染色。
10.染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。
11.扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。
由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有:①可以随意控制胶浓度”T”和交联度”C”,从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9 ~10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2 ,没有带电的其他离子基团,化学惰性好,电泳时不会产生”电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存。⑥无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。
注意事项
1.在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气,防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。
2.过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。
3.分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用,以使凝胶充分聚合,改善电泳时的分辨率。
4.为防止气泡陷入,梳子应倾斜插入。
5.如果带着梳子过夜可能会影响分辨率,所以浓缩胶最好在使用前再灌制。
6.如果没有足够数目的样品,应在加样孔中加样品缓冲液,不要留有空孔,以防止电泳时邻近的带扩展。
7.对样品浓度不确定的情况下,加样时使用梯度加样法,能大致估计出样品的浓度。
配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月,在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂,操作时要避免直接接触皮肤,但它们聚合后则无毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷,它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用,因而可以得到较高的分辨率,尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性,对于生物大分子的鉴定有重要意义,其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳,电泳后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,对某个特定的生物大分子进行鉴定,另一半用于所有样品的染色,以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

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